Wie wirkt sich die Wasserreinheit auf die Ergebnisse der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie aus?

Sie haben gerade eine Verlaufsmethode ausgeführt, die letzte Woche perfekt funktioniert hat. Die Kalibrierungsstandards sehen sauber aus, aber das Probenchromatogramm zeigt einen zusätzlichen Peak bei 23,8 Minuten. Sie ersetzen die Säule, bereiten frischen Puffer vor und überprüfen den Detektor. Der Höhepunkt ist immer noch da. Dann tauscht man das Wasser aus, das in die mobile Phase gelangt, und das Artefakt verschwindet. Das ist die Realität der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Hinter jeder Trennung steht die Reinheit des Wassers, und wenn sie sich ändert, ändert sich auch die Methode.

Die Wasserreinheit beeinflusst die Qualität der HPLC-Daten auf vier praktische Arten: Basislinienstabilität, Peakform, Retentionsreproduzierbarkeit und Gerätelebensdauer. Bei den beteiligten Schadstoffen kann es sich um organische Moleküle, gelöste Ionen, Partikel oder Mikroben handeln. Selbst eine kleine Menge einer Verunreinigungsart kann Folgen haben, die in keinem Verhältnis zu ihrer Konzentration stehen.

Die wichtigsten Auswirkungen der Wasserreinheit auf die HPLC

In einem HPLC-System ist Wasser ein Reagens und kein passiver Hintergrund. Es trägt den Puffer, löst die Probe und trägt zum Detektorhintergrund bei. Verunreinigungen im Wasser gehen daher direkt in das Analysesignal ein. Die folgende Tabelle fasst die häufigsten Schadstoffe und ihre Auswirkungen zusammen.

Diese Effekte sind nicht nur theoretisch. Ein mikrobieller Biofilm in einem Wasserreservoir kann UV-absorbierende Metaboliten freisetzen. Sobald sich dieser Film gebildet hat, kann das Problem möglicherweise nicht durch einfaches Ersetzen des Wassers gelöst werden, bis das Reservoir gereinigt und desinfiziert ist.

Was „HPLC-Qualität“ und Typ-1-Wasser eigentlich bedeuten

Die meisten Analysemethoden erfordern Wasser, das den Typ-1-Spezifikationen entspricht. In der Praxis bedeutet das, dass der spezifische Widerstand bei 25 Grad Celsius etwa 18,2 Megaohm-Zentimeter beträgt, die Leitfähigkeit etwa 0,055 Mikrosiemen pro Zentimeter beträgt und der gesamte organische Kohlenstoff so niedrig ist, dass das Wasser keinen sichtbaren UV- oder MS-Hintergrund erzeugt. Der spezifische Widerstand allein reicht nicht aus. Sie müssen außerdem den TOC-Gehalt, die Partikelanzahl und in einigen Anwendungen die Silikat- oder Natriumwerte kennen.

Der pH-Wert von gereinigtem Wasser ist keine nützliche Spezifikation. Reinstwasser hat fast keine Pufferkapazität und absorbiert schnell Kohlendioxid aus der Luft, sodass ein gemessener pH-Wert um 5,6 lediglich gelöstes CO2 widerspiegelt. Der pH-Wert, der zählt, ist der pH-Wert der gepufferten mobilen Phase, die Sie vorbereiten.

Die Anforderungen an die Wasserqualität hängen auch vom Detektor ab. Die UV-Detektion bei 210 nm ist besonders empfindlich gegenüber organischen Verunreinigungen, da dort viele Kohlenstoff-Sauerstoff- und Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen absorbieren. LC-MS benötigt Wasser mit sehr geringen nichtflüchtigen Verunreinigungen, um eine Ionenunterdrückung und Adduktbildung zu vermeiden. Auch Verdunstungsdetektoren werden durch nichtflüchtige Verunreinigungen beeinträchtigt, da sie das Hintergrundsignal erhöhen. Wasser vom Typ 1 ist daher ein guter Ausgangspunkt für fast jede HPLC-Anwendung.

Abgefülltes Wasser in HPLC-Qualität kann funktionieren, es muss jedoch korrekt gelagert und gehandhabt werden. Überprüfen Sie das Analysezertifikat, notieren Sie die Chargennummer und gehen Sie niemals davon aus, dass ein alter Behälter frei von biologischem Bewuchs ist.

Gradientenelution macht Wasserverunreinigungen sichtbar

Wasserverunreinigungen sind bei Gradientenmethoden am deutlichsten sichtbar. Bei einem isokratischen Lauf kann ein UV-absorbierender Schadstoff die Grundlinie einfach ein wenig anheben. Bei einem Gradienten beginnt der Wasseranteil hoch und der organische Lösungsmittelanteil steigt mit der Zeit an. Verunreinigungen können am Kopf der Säule zurückgehalten und dann mit zunehmendem organischen Gehalt eluiert werden. Dadurch entstehen Geisterpeaks und eine abweichende Basislinie, die die Integration und Quantifizierung beeinträchtigen können.

Deshalb ist ein Blindgefälle eine der einfachsten Kontrollen der Wasserqualität. Führen Sie Ihren exakten Gradienten durch, ohne eine Probe zu injizieren. Wenn in der Blindprobe Spitzen auftreten, ist die mobile Phase verdächtig.

Tägliche Gewohnheiten, die die Wasserreinheit schützen

Reines Wasser bleibt nicht zufällig rein. Die folgenden Gewohnheiten verhindern die häufigsten Probleme in der HPLC-Praxis.

• Verwenden Sie Wasser aus einem Reinigungssystem mit frischen Kartuschen, einer funktionierenden UV-Lampe und regelmäßiger Desinfektion.
• Sammeln Sie Wasser in einem sauberen, verschlossenen Behälter. Lassen Sie den Behälter nicht offen, während das System läuft.
• Lagern Sie Wasser nicht tagelang. Bereiten Sie die mobile Phase möglichst noch am selben Tag mit frischem Wasser vor.
• Vermeiden Sie es, frisches Wasser in einen teilweise gefüllten Behälter zu füllen. Ersetzen Sie den Inhalt des Behälters, anstatt ihn aufzufüllen.
• Führen Sie einen leeren Gradienten bei der für die Analyse verwendeten Wellenlänge durch und zeichnen Sie das Ergebnis auf.
• Dokumentieren Sie den spezifischen Widerstand, den TOC und das Datum der Wasserentnahme in Ihren Analyseunterlagen.

Für Labore, die Wasser in Flaschen verwenden, gelten die gleichen Regeln. Überprüfen Sie das Verfallsdatum, schließen Sie den Behälter sofort nach Gebrauch und geben Sie kein unbenutztes Wasser aus einem Becher in die Flasche zurück.

Zusatzstoffe machen aus einem Wasserproblem ein Methodenproblem

Mobile Phasen enthalten selten Wasser allein. Puffersalze, Säuren, Ionenpaarreagenzien und einige spezielle Modifikatoren werden in relativ geringen Konzentrationen hinzugefügt. Wenn das Wasser Spuren von UV-absorbierenden Verunreinigungen enthält, verändern diese Verunreinigungen möglicherweise nicht die Pufferkapazität, können aber dennoch im Detektorsignal erscheinen.

Ionische Flüssigkeiten werden manchmal als Modifikatoren für die mobile Phase verwendet, um die Peakform oder Selektivität zu verbessern. Wenn Sie sich für eines entscheiden, sollte derselbe Reinheitsstandard gelten. Zum Beispiel, 1-Ethyl-3-methylimidazoliumtetrafluorborat ist eine gängige ionische Flüssigkeit für chromatographische Studien. Es sollte in Wasser gelöst werden, das bereits den Typ-1-Spezifikationen entspricht; Andernfalls wird der Zusatzstoff zu einer weiteren Kontaminationsquelle. Wenn Sie die trennungsbezogenen Eigenschaften dieser Verbindungen verstehen möchten, wenden Sie sich an unsere Überblick über die Leistung ionischer Flüssigkeiten in Trennprozessen deckt die praktischen Variablen ab.

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Reinheit beginnt beim Lieferanten

Bei Zhejiang Ldet stellen wir ionische Flüssigkeiten und Spezialchemikalien her. Aus der Produktion wissen wir, dass eine Spurenverunreinigung in einem Ausgangsmaterial die Leistung nachgelagerter Prozesse beeinträchtigen kann. Deshalb prüfen wir vor der Freigabe Wassergehalt, Resthalogenide und UV-Verhalten. Die gleiche Disziplin gehört in ein HPLC-Labor: Wählen Sie Materialien aus, für die dokumentierte Spezifikationen vorliegen. Zum Beispiel, 1-Butyl-3-methylimidazoliumtetrafluorborat ist mit Reinheitsdaten verfügbar, anhand derer Sie beurteilen können, ob es mit Ihrer Nachweismethode kompatibel ist.

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Was auf einem Analysezertifikat zu überprüfen ist

• Resthalogenidgehalt, da Halogenide Ionenaustauschtrennungen und Korrosion beeinträchtigen können.
• Wassergehalt, da Wasser die wirksame Konzentration des Zusatzstoffes verändert.
• Ein UV-Spektrum oder UV-Grenzwert, damit Sie die Hintergrundabsorption vorhersagen können.
• Konsistenz von Charge zu Charge, da eine neue Charge Ihre Methode nicht stillschweigend ändern sollte.

Wenn Sie Hilfe bei der Zuordnung eines Materials zu einer Methode benötigen, können Sie dies tun Besprechen Sie Reinheitsdaten und kundenspezifische Anforderungen mit unserem technischen Team .

Behandeln Sie Wasser als Teil der Methode

Die Wasserreinheit in der HPLC ist keine einmalige Angelegenheit. Es handelt sich um eine tägliche Variable, die sich je nach Jahreszeit, der Vorratsflasche und dem Zustand des Reinigungssystems ändern kann. Verwenden Sie Wasser vom Typ 1, überprüfen Sie den TOC-Wert und den spezifischen Widerstand, gehen Sie richtig damit um und wählen Sie Zusätze mit Rückverfolgbarkeit. Bei einer Methode, die auf Nanogrammen Analyt basiert, ist Wasser niemals „nur Wasser“.